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Plos Biology | 汤富酬课题组与乔杰课题组合作绘制人类视网膜高精度发育细胞图谱

日期: 2019-07-05

人類胚胎發育從受精卵開始,經過著床前胚胎發育(胚內和胚外組織的産生),原腸胚産生(三胚層的特化)和器官發生等階段,最終新生兒出生。人類胚胎發育從單個細胞到上萬億個細胞,曆時二百八十天,整個過程的基因表達受到多種因素的精細調控,其中很多機制尚未明確。

爲了解析人類胚胎發育各個階段的基因表達調控網絡,自2010年起,北京大學北京未來基因診斷高精尖創新中心、生命科學學院湯富酬課題組和北醫三院喬傑課題組就開始緊密合作,圍繞人類生殖系細胞(包括著床前胚胎細胞和著床後胚胎生殖細胞)發育的基因表達調控機制系統地開展研究工作(如圖1所示)。

首先,应用汤富酬课题组发展的单细胞转录组高通量测序技术,汤富酬课题组和乔杰课题组绘制了完整的人类生殖系细胞的发育细胞图谱,包括着床前胚胎的发育细胞图谱(Yan et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2013; Dang et al., Genome Biology, 2016)和着床后胚胎生殖细胞的发育细胞图谱(Guo et al., Cell, 2015;Li et al., Cell Stem Cell, 2017),并对其DNA甲基化、染色质状态等不同层面的表观遗传学调控机制进行了深入的研究(Guo et al., Nature, 2014; Guo et al., Cell Research, 2017; Zhu et al., Nature Genetics, 2018; Li et al., Nature Cell Biology, 2018)。这两个团队还与南方医科大学赵小阳课题组合作完成了人类成年男性精子发生过程中的细胞命运转变和基因表达图谱的绘制(Wang et al.,Cell Stem Cell, 2018)。

圖1湯富酬課題組和喬傑課題組合作項目概覽

此后,两个团队全面展开对人类生殖系细胞以及非生殖系的各种重要器官的发育细胞图谱的研究,最终目标是绘制出人类胚胎发育所有重要阶段、所有主要器官系统的高精度发育细胞图谱。2018年,他们与中科院生物物理所王晓群课题组等合作,绘制了首个来自外胚层的人脑前额叶发育的单细胞图谱,揭示了神经元分化的成熟机制(Zhong et al., Nature, 2018)。他们还对人类胚胎大脑皮层的所有主要脑区进行了单细胞转录组研究,揭示了大脑皮层的区域化基因表达和神经元成熟的重要特征 (Fan et al., Cell Research, 2018)。上述工作为绘制完整的人脑发育细胞图谱奠定了重要的基础。与此同时,对来自内胚层的消化道四种主要器官(食道、胃、小肠和大肠),两个团队研究了它们在人类胚胎发育过程中的基因表达图谱及其信号调控机制,进一步解析了从胎儿到成年大肠的发育、成熟路径和关键生物学特征 (Gao et al., Nature Cell Biology, 2018)。另外,这两个团队还合作开展了对来自中胚层的肾脏和心脏的发育细胞图谱研究。对于肾脏,他们深入研究了完整肾单位的细胞分化发育过程,阐释了由肾单位前体细胞逐步分化产生不同类型的肾小管上皮细胞过程中对应的转录调控事件和信号通路调节机制(Wang et al., Cell Reports, 2018)。对于心脏,他们揭示了心脏发育过程中关键信号通路的时空特异性激活特征以及心肌细胞与非心肌细胞之间的复杂信号互作机制,为心脏再生的研究提供了重要线索(Cui et al., Cell Reports, 2018)。

2019年7月3日,人类主要器官发育图谱又添新作,汤富酬课题组与乔杰课题组在《Plos Biology》杂志上在线发表了题为“Dissecting the transcriptome landscape of the human fetal neural retina and retinal pigment epithelium by single-cell RNA-seq analysis”(通过单细胞转录组分析解析人类胚胎视网膜神经层和色素上皮层的转录组图谱)的研究成果,对来自外胚层的视网膜进行了深入的发育细胞图谱研究。

眼睛是心靈的窗戶,而視網膜可以將外界的光轉化爲神經信號,是眼睛實現感光功能非常重要的組成部分。視網膜內層是神經層(主要包含視杆細胞、視錐細胞、雙極細胞、無長突細胞、水平細胞、神經節細胞和缪勒細胞等),外層是色素上皮層(如圖2所示)。目前,已有大量的基于小鼠模型的研究揭示了視網膜神經層和色素層的發育路線。但是,人類視網膜神經層和色素層發育的分子機制以及這兩層結構中的細胞間的相互作用關系尚未明確。該課題組對來自人類胚胎5周到24周的視網膜神經層和色素上皮層(RPE)的2400多個細胞進行了高精度單細胞轉錄組測序分析。主要發現有:

圖2人類視網膜神經層和色素上皮層的示意圖

1.    揭示了人类胚胎视网膜的关键时空发育特征

該研究對視網膜神經層和色素上皮層分別取樣,轉錄組分析(如圖3所示)顯示神經層特異表達神經系統發育相關的基因,而色素層特異表達的基因與視黃醇代謝相關。隨著胚胎的發育,這兩種組織都經曆了由早期的細胞增殖高度活躍的狀態到視覺感知逐漸成熟的狀態。發育後期兩者都參與視網膜的視覺感知,暗示了它們在發育後期可能存在功能上的相互作用。

圖3視網膜神經細胞和色素上皮細胞的轉錄組特征

該研究鑒定出了各個類群對應的細胞類型(如圖4所示),描繪了各個細胞類型的轉錄組圖譜,並且揭示了體內發育過程中各種主要的視網膜神經細胞發生的准確時間。例如,在人類胚胎發育的第5周,視神經節細胞已經出現,並在第8周時細胞密度達到峰值。在胚胎第7周的時候可以檢測到水平細胞,在胚胎第9周,這種細胞的密度達到峰值。隨後,無長突細胞,光感受器細胞和缪勒細胞等相繼出現。

圖4人類胚胎視網膜的主要細胞類型和細胞發生時序

2.揭示了參與視網膜發育的細胞類型特異的轉錄因子及其靶標基因

視網膜發育研究的一個重要生物學問題是受轉錄因子調控的細胞命運決定的機制研究。該研究提供了一個關鍵的轉錄因子圖譜。這些轉錄因子在視網膜神經細胞和色素上皮細胞中高度活躍,並且它們的靶標基因參與了視網膜發育的重要事件(如圖5所示)。例如,轉錄因子RAX2主要在光感受器細胞中活躍,隨著視網膜的發育,有一部分RAX2靶標基因的表達上調,這些基因參與了視覺感知和光刺激的檢測,這與光感受器細胞的功能相符。MITF只在色素上皮細胞中有很高的活性,它的靶標基因在早期參與氨基酸的轉運和神經管的閉合,晚期參與陽離子的轉運。整個發育過程中,有一部分MITF的靶標基因持續表達,這些基因參與色素沈澱和細胞動力的調控。MITF靶標基因參與的上述事件都與視網膜色素上皮細胞的功能吻合。

圖5細胞類型特異的轉錄因子及其靶標基因參與的發育事件

3.揭示了RPE細胞與光感受器細胞的重要相互作用

該研究提供了RPE細胞與光感受細胞相互作用的諸多線索(如圖6所示)。成體的視網膜中,RPE細胞與光感受器細胞共同參與視循環-光轉導通路。有報道稱光轉導始于視紫紅質吸收光子。在人類胚胎發育過程中,直到第24周,光感受器細胞中才第一次檢測到視紫紅質基因的表達。然而在視網膜色素細胞中,第13周的時候就可以檢測到一系列與視循環相關基因的表達。上述結果說明,胚胎發育的第13周,視網膜已經開始視循環,遠遠早于光轉導的發生。該研究還檢測到了成對的受體與配體基因在RPE細胞和光感受器細胞中的表達,這也爲研究兩種細胞的相互作用提供了重要線索。

圖6RPE細胞與光感受器細胞的相互作用

4.揭示了視覺相關疾病潛在靶點基因在發育過程中的時空特異性表達特征

该研究绘制了胚胎时期视网膜细胞中遗传疾病相关基因的表达谱。研究结果显示大部分疾病相关的基因在光感受器细胞,双极细胞和色素上皮细胞中富集。有报道显示,在中国人群中,USH2A, EYS和CRB1是导致遗传性视网膜营养不良贡献最大的三个基因。而在人类胚胎的视网膜中,USH2A主要在光感受器细胞中表达,EYS在双极细胞和光感受器细胞中高表达,CRB1在缪勒细胞和视网膜前体细胞中富集。视网膜前体细胞是对视网膜形成至关重要的细胞类群,该研究发现它还高表达CLRN1, KCNJ13和KIF11等基因,视网膜遗传性疾病相关的基因在视网膜前体细胞中的突变可能是研究疾病发展的重要线索。

總之,該研究繪制了高精度的人類視網膜單細胞轉錄組圖譜,解析了細胞類型特異的轉錄因子及其靶標基因參與的發育事件,探索了視網膜神經層與視網膜色素層在發育時期相互作用的方式,同時該研究還繪制了胚胎時期視網膜細胞的遺傳疾病相關基因的表達譜。這項成果爲人類視網膜發育的功能性研究和視網膜遺傳性疾病的研究提供了重要線索。

北京大学北京未来基因诊断高精尖创新中心、生命科学学院博士後胡玉琼,北医三院王晓晔,北京大学北京未来基因诊断高精尖创新中心、生命科学学院博士胡博强、博士生毛雨诺和陈依东为该论文的并列第一作者,汤富酬教授和乔杰教授为该论文的共同通讯作者。该项工作得到了国家重大科学研究计划、国家自然科学基金委、未来基因诊断高精尖创新中心以及生命科學聯合中心(CLS)等的支持。

原文鏈接:https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000365

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